Aktywność star

Z Wikipedii

Aktywność star - jest to obniżenie lub zanik specyficzności działania enzymów restrykcyjnych objawiający się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne. Wraz ze spadkiem specyficzności, cięciu podlegają miejsca coraz bardziej różne od oryginalnej sekwencji restrykcyjnej. Aktywność star bywa nazywana także nadtrawianiem, czy żargonowo nadtrawką (tak bywają nazywane także produkty cięcia enzymatycznego z aktywnością star). Obecnie produkowane są sztucznie rekombinowane enzymy ze zmniejszoną lub zniesioną aktywnością star. Nazwa zjawiska pochodzi od oznaczenia alternatywnej aktywności, w odróżnieniu od zwykłej, znakiem * (EcoRI* zamiast EcoRI).

Na pojawienie się aktywności star w reakcjach z udziałem enzymów restrykcyjnych ma wpływ wiele czynników (choć każdy z różną siłą i to zależnie od enzymu), między innymi:

• wysokie stężenie glicerolu (powszechny składnik buforów do przechowywania enzymów);
• nadmiar enzymu do ilości DNA;
• niska siła jonowa (<25mM);
• wysokie pH (>8,0);
• obecność odczynników organicznych (DMSO, etanol, glikol i inne);
• zastąpienie jonów Mg²⁺ innymi jonami metali dwuwartościowych: Mn²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Zn²⁺.

Aktywność star jest zwykle zjawiskiem niepożądanym, utrudniającym i wprowadzającym zmienność do przeprowadzanego eksperymentu. Problem ten staje się wyraźny w przypadku reakcji z użyciem kilku enzymów restrykcyjnych naraz (cięcie wielokrotne).

Aktywność star można redukować stosując się do zaleceń producenta enzymów, takich jak:

• używania enzymu w minimalnej ilości potrzebnej do pocięcia danej ilości DNA (zmniejsza ilość glicerolu w próbce oraz zapewnia odpowiedni stosunek enzymu do DNA, wydłuża jednak czas reakcji);
• pozbycie się śladów odczynników organicznych (szczególnie etanolu używanego powszechnie do izolacji DNA);
• zapewnienie odpowiednio wysokiej lub specjalne zawyżanie siły jonowej (niektóre enzymy są jednak inhibowane przez wysoką siłę jonową);
• utrzymywanie pH reakcji w okolicach 7,0 (wyższe pH reakcji bywa efektem używania niewystarczająco czystego DNA izolowanego metodą lizy alkalicznej);
• używanie Mg²⁺ jako jonów dwuwartościowych wspomagających pracę enzymu i unikanie zanieczyszczeń innymi jonami.

[edytuj] Bibliografia

• Nasri M., Thomas D. Relaxation of recognition sequence of specific endonuclease HindIII.. Nucleic Acids Res. 03;14, 2, 811-21. 1986. PMID 3003698.
• George J., Blakesley RW., Chirikjian JG. Sequence-specific endonuclease Bam HI. Effect of hydrophobic reagents on sequence recognition and catalysis.. J Biol Chem. 09;255, 14, 6521-4. 1980. PMID 6248525.
• Polisky B., Greene P., Garfin DE., McCarthy BJ., Goodman HM., Boyer HW. Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease.. Proc Natl Acad Sci U S A. 02;72, 9, 3310-4. 1976. PMID 242001.
• Petronzio T., Schildkraut I. Altered specificity of restriction endonuclease HinfI.. Nucleic Acids Res. 08;18, 12, 3666. 1990. PMID 2362828.
• Kriss J., Herrin G., Forman L., Cotton R. Digestion conditions resulting in altered cut site specificity for HinfI.. Nucleic Acids Res. 08;18, 12, 3665. 1990. PMID 1972980.
• Malyguine E., Vannier P., Yot P. Alteration of the specificity of restriction endonucleases in the presence of organic solvents.. Gene. 05;8, 2, 163-77. 1980. PMID 6244210.
• Nasri M., Thomas D. Alteration of the specificity of PvuII restriction endonuclease.. Nucleic Acids Res. 12;15, 19, 7677-87. 1987. PMID 2823216.
• Barany F. The TaqI 'star' reaction: strand preferences reveal hydrogen-bond donor and acceptor sites in canonical sequence recognition.. Gene. 09;65, 2, 149-65. 1988. PMID 2842230.
• Gardner RC., Howarth AJ., Messing J., Shepherd RJ. Cloning and sequencing of restriction fragments generated by Eco RI*.. DNA. 05;1, 2, 109-15. 1983. PMID 6299666.
• Bitinaite J., Schildkraut I. Self-generated DNA termini relax the specificity of SgrAI restriction endonuclease.. Proc Natl Acad Sci U S A. 02;99, 3, 1164-9. 2002. doi:10.1073/pnas.022346799. PMID 11818524.