Zielone białko fluoryzujące
Z Wikipedii
Zielone białko fluoryzujące (ang. green fluorescent protein, GFP) – naturalnie występujące białko wykazujące fluorescencję. GFP jest małym białkiem (238 aminokwasów) pochodzącym z meduzy Aequorea victoria, u której pełni nie do końca zrozumiałą funkcję.
[edytuj] Struktura GFP
GFP posiada strukturę tzw. beta-beczułki, tzn. w stukturze II-rzędowej tego białka dominuje forma beta, a poszczególne harmonijki układają się względem siebie antyrównolegle zamykając strukturę całego białka w cylindrycznej formie (patrz rysunek). Po obu stronach beczułki łańcuch polipeptydowy tworzy pętle zabezpieczające wnętrze struktury. Wnętrze owo jest o tyle „cenne”, że w nim właśnie znajduje się fluorofor. Składają się na niego trzy aminokwasy (seryna, tyrozyna, glicyna), które w otaczającym je środowisku ulegają cyklizacji i dehydratacji, co prowadzi do powstania fluoryzującego układu sprzężonych wiązań podwójnych (na rysunku zaznaczonego jaśniejszym kolorem).
[edytuj] Zastosowanie GFP
GFP jest bardzo użytecznym białkiem w biologii molekularnej komórki. Jego łatwa wizualizacja sprawia, że znakomicie sprawdza się jako gen reporterowy, służący do badania np. aktywności promotorów lub wydajności transfekcji komórek. Dodatkowo, metodami inżynierii genetycznej można tworzyć białka fuzyjne złożone z GFP i badanego białka, co pozwala na uwidocznienie lokalizacji tego białka w komórce lub zmiany tej lokalizacji pod wpływem różnych czynników.
[edytuj] Modyfikacje GFP
Wkrótce po odkryciu białko GFP zostało zmodyfikowane na wiele sposobów, głównie poprzez wprowadzanie przypadkowych mutacji, co ułatwiło i rozszerzyło jego wykorzystanie. Po pierwsze zwiększono wydajność jego fluorescencji a powstałe białko nazwano EGFP (ang. enhanced green fluorescent protein – wzmocnione zielone białko fluoryzujące).
Zmiany udało się również wprowadzić w długości emitowanego światła, czyli w kolorze w jakim zmutowane białka "świecą". Powstały w ten sposób białka świecące na niebiesko (blue, BFP), cyjanowo (cyan, CFP), żółto (yellow, YFP) i czerwono (red, RFP).
Każde z tych białek dodatkowo zmodyfikowano w celu zwiększenia wydajności fluorescencji, czyli intensywności świecenia. Tak powstały kolejne wzmocnione (enhanced) białka fluoryzujące – EBFP, ECFP i EYFP.
Te modyfikacje, podobnie jak „oryginalne” białko GFP, pozwalają na badanie aktywności kilku różnych promotorów jednocześnie, a tym samym wpływ jednych promotorów na inne. Ponadto, można uwidaczniać w komórkach kilka badanych białek jednocześnie, poprzez połączenie każdego z tych białek z białkami fluoryzującymi na różne kolory.
Dodatkową korzyścią płynącą z zastosowania różnych długości emisji światła przez różne warianty białka jest wykorzystanie ich do badania asocjacji białek (np. heterodimeryzacji receptorów błonowych) przez wykorzystanie zjawiska rezonansowego transferu energii Förster’a (ang. Förster resonance energy transfer, FRET). Jedno z badanych białek łączy się z jednym białkiem fluorescencyjnym, a drugie – z białkiem, którego maksimum absorpcji bliskie jest maksimum emisji pierwszego białka fluoryzującego. W ten sposób, w formie niezasocjowanej obserwuje się świecenie obu białek, a po ich asocjacji – tylko białka sprzęgniętego z białkiem emitującym światło o większej długości fali.
