Иммуноферментный анализ

Материал из Википедии — свободной энциклопедии

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunoSorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов.

В основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) лежит принцип взаимодействия иммуносорбента — антигена возбудителя инфекции с выявляемыми антителами и в соединении этого комплекса антиген-антитело с иммуноглобулинами, содержащим ферментную метку.

Иммуноглобулины, применяемые в таких тест-системах, так называемый конъюгат может быть получен на основе антивидовых антител (например, кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или на основе антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определённого класса (M, G, А).

В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин M).

Существует несколько методов постановки реакции, однако в настоящее время используются в основном следующая схема:

На лунках тест-планшета зафиксирован антиген возбудителя, который инкубируется с испытуемой сывороткой или плазмой крови. При наличии в них специфических антител происходит связывание их с образованием комплекса антиген-антитело.

При инкубации этого комплекса с мечеными ферментом иммуноглобулинами происходит присоединение их к имеющимся комплексам антиген-антитело, что приводит к взаимодействию субстрата с ферментом и отмечается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител.

Результат оценивается спектрофотометрически или визуально. По такому принципу построена основная масса тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

Однако следует отметить, что иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты. Ложноположительные могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорожденных такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, а также техническими ошибками при постановке реакции.

В зависимости от того, какие антигены используются, все иммуноферментные тест-системы для выявления антител подразделяются на:

Лизатные — в которых используется нативный антиген (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определенных белковых антигенов возбудителя;
Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.

Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог любого отдельного антигена.

Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы высокоиммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам в достаточно большом количестве) и высокоспецифичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и не дающими перекрёстных реакций с антителами другой природы).

Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности.

На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.

Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.