EcoRV
Z Wikipedii
EcoRV (wym. "eko er pięć", ewentualnie "eko er fał") - enzym, endonukleaza restrykcyjna typu II, wyizolowana po raz pierwszy ze szczepu E.coli[1], jest częścią bakteryjnego systemu modyfikacji restrykcyjnych.
W biologii molekularnej EcoRV jest używane jako enzym restrykcyjny. Przy cięciu DNA tworzy tępe końce (patrz: lepkie końce). Sekwencją rozpoznawaną i ciętą przez enzym jest palindromiczna sekwencja 5'-GAT▼ATC-3' (nić komplementarna 3'-CTA▲TAG-5')[2].
Spis treści |
[edytuj] Struktura
Struktura przestrzenna enzymu została rozwiązana metodami rentgenograficznymi w 1997 roku[3].
[edytuj] Struktura trzecio- i czwartorzędowa
Rdzeń enzymu składa się z pięcioniciowych β-harmonijek flankowanych przez helisy-α. Motyw ten jest konserwatywnie zachowany we wszystkich innych restrykcyjnych endonukleazach typu II. W strukturze można także wyróżnić N-końcową subdomenę dimeryczną, utworzoną przez krótka helisę-α, dwuniciowe antyrównoległe β-harmonijki i długą α-helisę. Ta subdomena jest obecna wyłącznie w enzymach EcoRV i PvuII[4].
[edytuj] Działanie
Podobnie do EcoRI, EcoRV tworzy homodimer zanim zwiąże się z DNA i rozpozna swoje miejsce cięcia[5]. Początkowo enzym słabo wiąże się do nici DNA, po czym zaczyna poruszać się w sposób losowy po nici, szukając rozpoznawanego miejsca restrykcyjnego[4]. EcoRV cechuje duża specyficzność w rozpoznawaniu sekwencji docelowej, szczególnio in vivo[2]. Po związaniu DNA w miejscu restrykcyjnym, enzym wymusza zmiany konformacyjne DNA, wyginając jego nić o jakieś 50°. W rezultacie rozluźnia to oddziaływania pomiędzy parami zasad, poszerza małą bruzde, a zacieśnia dużą bruzdę w cząsteczce DNA. To zbliża, podlegające cięciu, wiązania fosfodiestrowe do miejsca aktywnego enzymu. Samo cięcie nie wymaga hydrolizy ATP. EcoRV jest jedyną znaną restryktazą II typu wywołującą tak duże zmiany konformacyjne w DNA[4].
[edytuj] Zastosowania
Z powodu swojej selektywności i specyficznego miejsca cięcia, które następnie może ulec ligacji (aczkolwiek z powodu tępych końców, mniej efektywnej) (zobacz też: ligaza), enzym ten jest używany w biologii molekularnej, szczególnie w technice klonowania. Enzym do poprawnej pracy wymaga dodania do buforu BSA [6].
Przypisy
- ↑ Kholmina GV., Rebentish BA., Skoblov IuS., Mironov AA., Iankovskiĭ NK. [Isolation and characteristics of the new site-specific endonuclease Eco RV]. Dokl Akad Nauk SSSR. 253, 2, 495-7. 1981. PMID 6253247.
- ↑ 2,0 2,1 Taylor JD., Goodall AJ., Vermote CL., Halford SE. Fidelity of DNA recognition by the EcoRV restriction/modification system in vivo.. Biochemistry. Dec 4;29, 48, 10727-33. 1991. PMID 2176880.
- ↑ Perona JJ., Martin AM. Conformational transitions and structural deformability of EcoRV endonuclease revealed by crystallographic analysis.. J Mol Biol. Oct 17;273, 1, 207-25. 1997. doi:10.1006/jmbi.1997.1315. PMID 9367757.
- ↑ 4,0 4,1 4,2 Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases.. Nucleic Acids Res. Sep 15;29, 18, 3705-27. 2001. PMID 11557805.
- ↑ Bitinaite J., Wah DA., Aggarwal AK., Schildkraut I. FokI dimerization is required for DNA cleavage.. Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 1;95, 18, 10570-5. 1998. PMID 9724744.
- ↑ Karta charakterystyki enzymu ze strony producenta (en)
