Chemiczna synteza oligonukleotydów

Z Wikipedii

Chemiczna synteza oligonukleotydów - proces otrzymywania metodami chemicznymi krótkich (maksymalnie do ok. 200 jednostek nukleotydowych, zwykle ok. 20) fragmentów DNA lub RNA (oligonukleotydów) o zdefiniowanej sekwencji zasad nukleotydowych.

Do reakcji wykorzystuje się zazwyczaj jednostki nukleotydowe, posiadające w pozycji 3'-O aktywowaną grupę fosforanową lub jej analog, do której przyłączane są kolejno następne jednostki posiadające wolną grupę 5'-OH. Pozostałe centra reaktywne niebiorące udziału w danej reakcji są zablokowane grupami ochronnymi. Odpowiedni dobór i manewrowanie grupami ochronnymi pozwala na uzyskanie bardzo wysokiej wydajności tworzenia wiązania internukleotydowego (> 99%).

W przeciwieństwie do metod enzymatycznych, podejście chemiczne pozwala na łatwe wprowadzanie różnorodnych modyfikacji we wszystkich elementach syntezowanego oligonukleotydu (tj. na zasadzie heterocyklicznej, szkielecie cukrowym oraz reszcie fosforanowej). Najczęściej modyfikacje takie stosowane są w celu zwiększenia odporności na enzymy hydrolityczne, polepszenia hybrydyzacji z komplementarną nicią kwasu nukleinowego oraz do wprowadzania znaczników, np. fluorescencyjnych. Modyfikowane oligonukleotydy znajdują zastosowanie w terapii antysensowej.

Spis treści 1 Grupy ochronne 2 Przebieg syntezy 3 Strategie syntezy 3.1 Podział ze względu na centrum fosforowe 3.2 Podział ze względu na fazę 3.3 Podział ze względu na wielkość łączonych jednostek 3.4 Podział ze względu na automatyzację 3.5 Podział ze względu na skalę 4 Literatura 5 Przypisy

[edytuj] Grupy ochronne

Najczęściej stosowane zestawy grup ochronnych (blokujących):

• zasady heterocykliczne: grupa benzoilowa, grupa izobutyrylowa, grupa fenoksyacetylowa (grupy zasadowolabilne);
• centrum fosforowe: grupa cyjanoetylowa (grupa zasadowolabilna w metodzie amidofosforynowej), grupa chloro- lub nitrofenylowa (grupa usuwana oksymami w metodzie triestrowej);
• pozycja 2'-OH rybozy: grupa tertbutylodimetylosililowa (usuwana jonami F^-); grupa tetrahydropiranylowa (kwasowolabilna);
• pozycja 3'-OH: grupa benzoilowa, grupa lewulinylowa;
• pozycja 5'-OH: grupa dimetoksytrytylowa DMTr (kwasowolabilna).

[edytuj] Przebieg syntezy

Metody syntezy można pogrupować w zależności od zastosowanej chemii, fazy, skali itd. Obecnie najczęściej stosowanym podejściem jest automatyczna synteza metodą amidofosforynową na podłożu stałym. Składa się ona z powtarzanych kolejno cykli syntetycznych prowadzących do przyłączania kolejnych nukleotydów do łańcucha oligonukleotydowego rosnącego na podłożu stałym:

• START: Podłoże stałe posiada pierwszy nukleozyd, przyłączony końcem 3'.

1. Przemycie roztworem kwasu w celu usunięcia grupy DMTr z pozycji 5'-O.
2. Przemycie roztworem zaaktywowanego 3'-amidofosforynu odpowiedniego nukleozydu. Nukleotyd zostaje przyłączony wiązaniem fosforynowym.
3. Przemycie roztworem jodu zawierającym wodę. Fosforyn utlenia się do fosforanu.
4. Kapowanie - przemycie roztworem bezwodnika octowego w celu zablokowania grup 5'-OH, do których nie przyłączył się amidofosforyn.
5. Powrót do punktu 1. Procedurę powtarza się aż do uzyskania pożądanego oligonukleotydu.

Po zakończeniu syntezy oligonukleotyd podlega procesowi izolacji:

1. Końcowe odblokowanie: poprzez umieszczenie podłoża stałego z oligonukleotydem w roztworze amoniaku uzyskuje się:
   1. odcięcie oligonukleotydu od podłoża;
   2. odblokowanie grup ochronnych z zasad heterocyklicznych;
   3. odblokowanie reszty fosforanowej (β-eliminacja reszty cyjanoetylowej).
2. W przypadku RNA dodatkowym etapem jest odblokowanie pozycji 2'-OH za pomocą fluorków (np. fluorku tetrabutyloamoniowego, TBAF lub fluorowodorku trietyloamoniowego, TEA•3HF).
3. Oczyszczanie produktu za pomocą HPLC (jonowymiennej lub w fazie odwróconej) lub elektroforezy (PAGE). Dla krótkich oligonukleotydów (kilka jednostek nukleotydowych) stosować można również chromatografię cienkowarstwową^[1].
4. Liofilizacja gotowego oligonukleotydu.

[edytuj] Strategie syntezy

[edytuj] Podział ze względu na centrum fosforowe

• Metoda fosforanodiestrowa
• Metoda fosforanotriestrowa
• Metoda fosforynotriestrowa
• Metoda amidofosforynowa
• Metoda H-fosfonianowa

[edytuj] Podział ze względu na fazę

• Synteza w roztworze

Wszystkie reakcje przeprowadza się w roztworze. Po każdym etapie konieczne jest chromatograficzne oczyszczanie produktu. Metoda łatwa do zaadoptowania do skali przemysłowej.

• Synteza w roztworze z "kotwicą"

Pierwszy nukleozyd oligonukleotydu posiada "kotwicę" - cząsteczkę chemiczną (najczęściej glikol polietylenowy) pozwalającą na wytrącenie pożądanego produktu z roztworu, dzięki czemu unika się czasochłonnego oczyszczania związku.

• Synteza na podłożu stałym

Pierwszy nukleozyd oligonukleotydu przyłączony jest do podłoża stałego (zwykle jest to szkło o kontrolowanej porowatości (Controlled Pore Glass, CPG) lub kulki polistyrenowe) o wielkości ułamków milimetra. Podłoże takie przemywane jest roztworami odpowiednich substratów i rozpuszczalnikami. Pozwala to na stosowanie dużych nadmiarów reagentów (odmywanych następnie czystymi rozpuszczalnikami) i uzyskiwanie bardzo wysokich wydajności.

[edytuj] Podział ze względu na wielkość łączonych jednostek

• Synteza z monomerów
• Synteza blokowa

[edytuj] Podział ze względu na automatyzację

• Synteza ręczna
• Synteza maszynowa

[edytuj] Podział ze względu na skalę

• Skala biochemiczna (< 1 μmol)
• Skala półpreparatywna (1 - 10 μmol)
• Skala przemysłowa (kilogramowa)

[edytuj] Literatura

• Oligonucleotide synthesis: a practical approach, M. Gait (red.), Oxford:Oxford University Press, 1984.
• Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, F. Eckstein (red.), Oxford:Oxford University Press, 1991.
• Protocols for Oligonucleotides and Analogs. Synthesis and Properties, S. Agrawal (red.), Totowa, New Jersey:Humana Press Inc., 1993.
• Protocols for Oligonucleotide Conjugates. Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal (red.), Totowa, New Jersey:Humana Press Inc., 1994.

Przypisy