Elektroforeza
Z Wikipedii
Elektroforeza - technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.
Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w przybliżeniu wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.
Istnieje wiele wariantów tej techniki. W zależności od ośrodka, w którym następuje rozdział wyróżnić można elektroforezę bibułową (dziś już przestarzałą i praktycznie nie używaną), żelową i kapilarną.
Spis treści |
[edytuj] Elektroforeza żelowa
W elektroforezie żelowej ośrodkiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agarozy, poliakrylamidów[1], agaru lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu - kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku milimetrów (rzadziej jest to słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu - studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości (np. w formamidzie), dzięki czemu rozpływa sie na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prąd roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną, elektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie elektryczne rzędu 50-3000 V. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze) cząsteczki w oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można monitorować nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki (tzw. markery) o znanej mobilności elektroforetycznej.
BP, XC - markery.
Ścieżki A - C: absorpcja przy 254 nm;
D: fluorescencja przy 366 nm
Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie bądź obserwację absorpcji światła (zazwyczaj UV) przez żel. Wizualizację elektroforegramów preparatów znakowanych izotopowo uzyskuje się przez zaczernienie kliszy fotograficznej (autoradiogram). W przypadku technik preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się i poddaje procesowi elucji.
Elektroforeza jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek lub syntetycznych. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w przypadku białek) lub mocznika (w przypadku DNA lub białek).
Z poziomu molekularnego elektroforeza polega na ukierunkowanym przesuwaniu analizowanych cząsteczek przez prąd i ich interakcji z fazą stałą żelu, która w tej cząsteczkowej skali wygląda jak przestrzenna sieć. Bardziej ruchliwe są mniejsze cząsteczki bo łatwiej się przeciskają przez tą sieć, większe się opóźniają. Plusowy prąd uruchamia te które 'utknęły' po drodze i daje lepszej jakości rozdział.
Przykładowe markery do elektroforezy
- błękit bromofenolowy (BP)
- cyjanol ksylenowy (XC)
- oranż G.
Przykładowe substancje wybarwiające żel
- bromek etydyny
- coomassie blue
- srebro
- stains-all
[edytuj] Elektroforeza kapilarna
Elektroforeza kapilarna (CE, od ang. Capillary Electrophoresis), zwana też elektroforezą w wolnym buforze służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek (podobnie jak HPLC). Metoda ta jest często stosowana w biologii molekularnej do analizy DNA, znacznie rzadziej do rozdziału peptydów. Rozdział mieszanin prowadzony jest w cienkiej (wewn. średnica 25-100 µm) i długiej (0.5-1 m) kapilarze kwarcowej, przypominającej z wyglądu światłowód. Kapilara ta wypełniana jest buforem.
Próbka wprowadzana jest do wlotu kapilary, po czym jest do niej przykładane wysokie napięcie elektryczne (do 30 kV). U wylotu kapilary zamontowany jest detektor, który rejestruje wychodzenie z rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z elektrod. Dla układu wodnego jest to zwykle katoda.
Technika ta umożliwia rozdzielanie anionów i kationów soli organicznych i nieorganicznych.
Odmianą elektroforezy kapilarnej jest micelarna elektrokinetochromatografia (MEKC). W tej technice w buforze rozdziałowym znajduje się rozpuszczony detergent jonowy (np. dodecylosiarczan sodu - SDS) w takim stężeniu, aby tworzyć trwałą emulsję. Emulsja ta składa się z miceli, które są hydrofobowe wewnątrz i naładowane elektrycznie na swojej powierzchni.
Micele te dzięki swemu ładunkowi poruszają się z inną prędkością niż reszta buforu, a w ich wnętrzach zamknięte są cząsteczki związków chemicznych tworzących analizowaną mieszaninę. Pozwala to rozdzielać związki chemiczne, które nie przyjmują ładunku elektrycznego nawet po przyłożeniu dużego napięcia. Metoda ta umożliwia rozdział i analizę niemal wszystkich związków chemicznych rozpuszczalnych w wodzie.
