Western-blot
Z Wikipedii
Western-blot - metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca do wykrywania określonych białek.
Rozdziela zdenaturowane białka według ich mas oraz natywne (niezdenaturowane) według ich struktury 3-D, za pomocą elektroforezy w żelu (zwykle poliakrylamidowym). Później białka są przenoszone na membranę (zwykle nitrocelulozową lub PVDF). Obecność odpowiednich białek jest sprawdzana za pomocą barwników takich jak Ponceau S, czerń amidowa czy Coomassie Brilliant Blue lub za pomocą przeciwciał przyłączających się do ich epitopów.
Przed dodaniem przeciwciał membrana zostaje "zablokowana" przez zanurzenie w roztworze innego białka, zwykle żelatyny, albuminy surowicy krwi bydlęcej (BSA) lub odtłuszczonego mleka w proszku, często z dodatkiem detergentu (np. Tween 20) lub w roztworze samego detergentu, w celu uniemożliwienia niespecyficznego łączenia się przeciwciał z membraną.
Analogicznie do metody ELISA w metodzie Western-blot można używać jednego przeciwciała związanego ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwóch rodzajów przeciwciał - nieznakowanego, przeciwko wykrywanemu białku (przeciwciała pierwszorzędowe) oraz znakowanego, przeciwko danemu izotypowi immunoglobulin (przeciwciała drugorzędowe; metoda pośrednia).
Przeciwciała są znakowane zwykle enzymem (np. peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną), fluorochromem lub izotopem radioaktywnym. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję. W przypadku stosowania wizualizacji przez luminescencję lub stosowanie izotopów, obraz otrzymuje się przez przyłożenie membrany do kliszy fotograficznej.
