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Cromatografia

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Na foto é um sistema de cromatografia em fase gasosa sofisticado. Este instrumento regista as concentrações de acrilonitrilo no ar em vários pontos ao longo do laboratório químico.

Cromatografia [| krəʊmə | tɒgrəfi] (a partir de grego χρῶμα chroma "cor" e graphein γράφειν "escrever") é o termo coletivo para um conjunto de As técnicas laboratoriais de separação de misturas. A mistura é dissolvida em um fluido chamado a fase móvel, o que a leva através de uma estrutura que prende outro material chamado a fase estacionária. Os vários componentes da mistura de viagens em velocidades diferentes, fazendo com que se separem. A separação é baseada na compartimentação diferencial entre as fases móvel e estacionária. Diferenças sutis em um composto de coeficiente de partição resultado na retenção diferencial na fase estacionária e alterando assim a separação.

A cromatografia pode ser preparativa ou analítico. A finalidade da cromatografia preparativa é separar os componentes de uma mistura para o uso mais avançado (e, portanto, é uma forma de purificação). Cromatografia analítica é normalmente feito com quantidades menores de material e é para medir as proporções relativas dos analitos numa mistura. Os dois não são mutuamente exclusivas.

História

Cromatografia em camada fina é usado para separar componentes de um extracto de planta, que ilustra a experiência com pigmentos de plantas que deram o nome cromatografia

Cromatografia, literalmente "escrita cor", foi empregado pela primeira vez pelo cientista russo Mikhail Tsvet em 1900. Ele continuou a trabalhar com cromatografia na primeira década do século 20, principalmente para a separação de vegetais pigmentos tais como clorofila, carotenos, e xanthophylls. Uma vez que estes componentes têm cores diferentes (verde, laranja e amarelo, respectivamente) deram a técnica de seu nome. Novos tipos de cromatografia desenvolvidas durante os anos 1930 e 1940 fez a técnica útil para muitos processos de separação.

Cromatografia técnica desenvolvida substancialmente como um resultado do trabalho de Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge, durante os anos 1940 e 1950. Eles estabeleceram os princípios e técnicas básicas de cromatografia de partição, e seu trabalho incentivou o rápido desenvolvimento de vários métodos cromatográficos: cromatografia em papel, cromatografia gasosa, e que se tornaria conhecido como cromatografia líquida de alto desempenho. Desde então, a tecnologia tem avançado rapidamente. Os pesquisadores descobriram que os principais princípios de cromatografia de Tsvet poderia ser aplicada em muitas maneiras diferentes, resultando em diferentes variedades de cromatografia descritos abaixo. Os avanços estão a melhorar continuamente o desempenho técnico de cromatografia, permitindo a separação de moléculas cada vez mais semelhantes.

Termos de Cromatografia

  • A substância a analisar é uma substância a ser separados durante a cromatograf ia.
  • Cromatografia analítica é utilizada para determinar a existência e, possivelmente, também a concentração do analito (s) em um amostra.
  • A fase ligada é uma fase estacionária que é ligado covalentemente às partículas de suporte ou à parede interior do tubo de coluna.
  • Um cromatograma é a saída visual do cromatógrafo. No caso de uma separação óptima, diferentes padrões ou picos no cromatograma correspondem a diferentes componentes da mistura separada.
Chromatogram com picos não resolvidos Cromatograma com dois picos resolvidos
Representada no eixo-x é o tempo de retenção e representada graficamente no eixo dos y de um sinal (por exemplo, obtidas através de um espectrofotómetro, espectrómetro de massa ou uma variedade de outros detectores) correspondente à resposta criada pelos analitos que saem do sistema. No caso de um sistema óptimo do sinal é proporcional à concentração do analito específico separados.
  • Um cromatógrafo é um equipamento que permite a separação sofisticado por exemplo cromatografia em fase gasosa ou separação cromatográfica líquida.
  • A cromatograf ia é um método de separação física que distribui componentes para separar entre duas fases, uma estacionário (fase estacionária), enquanto que o outro (a fase móvel) se move numa direcção definida.
  • O eluato é a fase móvel que sai da coluna.
  • O eluente é o solvente que transporta a substância a analisar.
  • Um série eluotropic é uma lista de solventes classificados de acordo com seu poder de eluição.
  • Uma fase imobilizada é uma fase estacionária que está imobilizado sobre as partículas de suporte, ou na parede interior do tubo de coluna.
  • A fase móvel é a fase que se move numa direcção definida. Pode ser um líquido (LC e electrocromatografia capilar (CEC)), um gás (GC), ou um fluido supercrítico (cromatografia supercrítica de fluidos, SFC). A fase móvel é constituída por a amostra a ser separada / analisados e o solvente que se move a amostra através da coluna. No caso de HPLC de fase móvel é constituída por um solvente não polar (es), tais como o hexano em fase normal ou em solventes polares chromotagraphy de fase inversa e a amostra a ser separada. A fase móvel move-se através da coluna de cromatograf ia (fase estacionária), onde a amostra interage com a fase estacionária e é separado.
  • Cromatografia preparativa é usado para purificar quantidades suficientes de uma substância para utilização posterior, em vez de análise.
  • O tempo de retenção é o tempo característico que leva para um analito particular para passar através do sistema (a partir da entrada da coluna para o detector), sob condições definidas. Veja também: ?ndice de retenção de Kovats '
  • A amostra é a matéria analisada em cromatografia. Ele pode ser constituído por um único componente ou pode ser uma mistura de componentes. Quando a amostra é tratada no decurso de uma análise, a fase ou as fases que contêm os analitos de interesse é / são referidos como a amostra ao passo que tudo de interesse separado da amostra, antes ou no decurso da análise é referido como resíduos.
  • O soluto refere-se aos componentes da amostra em cromatograf ia de partição.
  • O solvente refere-se a qualquer substância capaz de solubilizar a outra substância, e, especialmente, a fase líquida móvel em cromatografia líquida.
  • A fase estacionária é a substância é fixada no lugar para o processo de cromatografia. Exemplos incluem a sílica em camada cromatografia em camada fina

Cromatografia baseia-se no conceito de coeficiente de partição. Qualquer partição do soluto entre dois solventes imiscíveis. Quando fazemos um imóvel solvente (por adsorção sobre uma matriz de suporte sólido) e outra móvel que resulta em aplicações mais comuns de cromatografia. Se o suporte de matriz é polar (por exemplo, papel, sica, etc.) é a frente cromatografia de fase, e se ele é não polar (C-18) é de fase inversa.

Técnicas por forma cama cromatográfica

A cromatografia em coluna

A cromatografia de coluna é uma técnica de separação em que o leito estacionário é dentro de um tubo. As partículas da fase estacionária sólida ou o suporte revestido com uma fase estacionária líquida pode preencher todo o volume interior do tubo (coluna de enchimento) ou ser concentrada em ou ao longo da parede interna do tubo deixando um caminho aberto, sem restrições para a fase móvel em a parte do meio do tubo (coluna tubular aberta). Diferenças nas taxas de movimento através do meio são calculados a diferentes tempos de retenção de amostra.

Em 1978, WC ainda introduziu uma versão modificada de cromatografia de coluna chamado flash de cromatografia de coluna (flash). A técnica é muito semelhante à cromatografia em coluna tradicional, excepto que o solvente é conduzido através da coluna por aplicação de pressão positiva. Isto permitiu que a maioria das separações para ser realizada em menos de 20 minutos, com separações melhoradas em comparação com o método antigo. Sistemas de cromatografia de flash modernos são vendidos como cartuchos de plástico pré-embalado, e o solvente é bombeado através do cartucho. Sistemas também podem ser ligados com detectores e coletores de frações fornecendo automação. A introdução de bombas de gradiente resultaram em separações mais rápidas e menos uso de solvente.

Em adsorção em leito expandido, um leito fluidizado é utilizada, em vez de uma fase sólida, feito por um leito compactado. Isto permite a omissão das etapas iniciais de compensação, tais como a centrifugação e a filtração, para caldos de cultura ou suspensões de células rebentadas.

Cromatografia em fosfocelulose utiliza a afinidade de ligação de muitas proteínas de ligação ao ADN de fosfocelulose. A forte interacção de uma proteína com ADN, quanto maior a concentração de sal necessária para eluir essa proteína.

Cromatografia planar

Cromatografia planar é uma técnica de separação em que a fase estacionária é presente como ou em um plano. O avião pode ser um papel, servindo como tal ou impregnados por uma substância como a cama estacionária ( cromatografia em papel) ou uma camada de partículas sólidas, distribuídos sobre um suporte, como uma placa de vidro ( A cromatografia em camada fina). Diferentes compostos na mistura amostra viajar distâncias diferentes de acordo com a força com que eles interagem com a fase estacionária, em comparação com a fase móvel. O específico Factor de retenção (Rf) de cada produto químico pode ser usado para ajudar na identificação de uma substância desconhecida.

Cromatografia em papel

Cromatografia em papel é uma técnica que envolve a colocação de um pequeno ponto ou da linha de solução da amostra para uma tira de papel de cromatografia. O papel é colocado em um frasco contendo uma camada superficial do solvente e selado. À medida que o solvente eleva-se através do papel, encontra-se a mistura de amostra, o qual começa a movimentar-se o papel com o solvente. Este papel é feito de celulose, uma substância polar, e os compostos dentro da mistura de viagens mais longe se eles são não-polar. Mais substâncias polares vínculo com o papel de celulose de forma mais rápida e, portanto, não viajar tão longe.

Cromatografia em camada fina

A cromatografia em camada fina (TLC) é uma técnica de laboratório amplamente empregues, e é semelhante à cromatografia em papel. No entanto, em vez de utilizar uma fase estacionária de papel, que envolve uma fase estacionária de uma fina camada de adsorvente como gel de sílica, alumina , ou celulose sobre uma superfície plana, inerte substrato. Comparado ao papel, ele tem a vantagem de corridas mais rápido, melhor e separações, a escolha entre diferentes adsorventes. Para ainda melhor resolução e para permitir uma quantificação, de alto desempenho TLC pode ser usado.

Cromatografia Deslocamento

O princípio básico de cromatografia de deslocamento é: Uma molécula com uma afinidade elevada para a matriz de cromatograf ia (a bóia) efectivamente compete para locais de ligação, e, assim, deslocar todas as moléculas com afinidades menores. Existem diferenças distintas entre deslocamento e cromatografia de eluição. No modo de eluição, substâncias normalmente emergem de uma coluna em estreitas, picos de Gauss. Plano de separação de picos, de preferência à linha de base, é desejada para um máximo de purificação. A velocidade a que qualquer componente de uma mistura viaja para baixo na coluna, em eluição modo depende de muitos factores. Mas para duas substâncias para viajar a velocidades diferentes, e deste modo ser resolvidos, deve haver diferenças substanciais em alguma interacção entre as biomoléculas e a matriz de cromatografia. Os parâmetros operacionais são ajustados para maximizar o efeito desta diferença. Em muitos casos, a separação de linha de base dos picos pode ser conseguido apenas com um gradiente de eluição de coluna e cargas baixas. Assim, dois inconvenientes a cromatografia modo de eluição, especialmente à escala preparativa, são a complexidade operacional, devido a bombagem de solvente de gradiente, e baixa taxa de transferência, devido a cargas baixas de coluna. Cromatografia de deslocamento tem vantagens sobre cromatografia de eluição em que os componentes são resolvidos em zonas consecutivas de substâncias puras, em vez de "picos". Uma vez que o processo tira vantagem de não-linearidade das isotérmicas, uma alimentação de coluna maior pode ser separado numa dada coluna com os componentes purificados recuperados em concentrações significativamente mais elevadas.

Técnicas de estado físico da fase móvel

Cromatografia em fase gasosa

A cromatografia gasosa (CG), também por vezes conhecida como a cromatografia gás-líquido, (GLC), é uma técnica de separação em que a fase móvel é um gás. A cromatografia de gás é sempre efectuada numa coluna, que geralmente é "embalado" ou "capilar" (ver abaixo).

A cromatografia de gás baseia-se numa equilíbrio de partição entre o analito imobilizado numa fase sólida (frequentemente um material à base de silicone líquido) e um gás móvel (na maioria das vezes hélio). A fase estacionária é aderida ao interior de um tubo de vidro de pequeno diâmetro (coluna capilar) ou uma matriz sólida no interior de um tubo de metal maior (uma coluna empacotada). É amplamente utilizada em química analítica ; embora as temperaturas elevadas utilizadas no GC torná-lo inadequado para biopolímeros de elevado peso molecular (ou proteínas de calor desnatura-los), frequentemente encontrados em bioquímica , que é bem adequado para uso no petroquímica, monitoramento ambiental e remediação, e campos químicos industriais. É também utilizado extensivamente em pesquisa química.

A cromatografia líquida

Aparelho de HPLC Preparativo

A cromatografia líquida (LC) é uma técnica de separação em que a fase móvel é um líquido. A cromatografia líquida pode ser efectuada quer em uma coluna ou um avião. Cromatografia líquida de hoje em dia que utiliza geralmente partículas muito pequenas de embalagem e uma pressão relativamente elevada é referido como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Em HPLC, a amostra é forçada por um líquido a alta pressão (fase móvel) através de uma coluna que é cheia com uma fase estacionária composto por partículas de forma irregular ou esférica, uma camada porosa monolítica, ou de uma membrana porosa. HPLC é historicamente dividida em duas sub-classes diferentes com base na polaridade das fases móveis e estacionários. Métodos em que a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel (por exemplo, tolueno como fase móvel, de sílica como fase estacionária) são denominados cromatografia líquida de fase normal, (NPLC) e o oposto (por exemplo, mistura de água e metanol como o móvel fase e C18 = octadecilsililo como a fase estacionária) é denominado invertida cromatografia líquida de fase (RPLC). Ironicamente, a "fase normal" tem menos aplicações e RPLC é, portanto, consideravelmente mais utilizado.

Técnicas específicas da presente rubrica ampla estão listados abaixo.

A cromatografia de afinidade

A cromatografia de afinidade é baseada na interacção não-covalente selectiva entre um analito e as moléculas específicas. É muito específico, mas não é muito robusto. Ele é frequentemente usado em bioquímica na purificação de proteínas ligadas a tags. Estes proteínas de fusão são marcadas com compostos tais como Seus-tags, ou biotina antigénios, que se ligam à fase estacionária, especificamente. Após purificação, algumas destas etiquetas são normalmente removido e a proteína pura é obtida.

A cromatografia de afinidade utiliza muitas vezes a afinidade de uma biomolécula por um metal (Zn, Cu, Fe, etc). As colunas são muitas vezes preparadas manualmente. Colunas de afinidade tradicionais são utilizados como uma etapa preparativa para expulsar biomoléculas indesejados.

No entanto, existem técnicas de HPLC que utilizam propriedades afinidade chromatogaphy. Cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado (IMAC) é útil para separar as moléculas acima mencionadas com base na afinidade relativa para o metal (Ie Dionex IMAC). Muitas vezes, estas colunas podem ser carregados com metais diferentes para criar uma coluna de afinidade com um alvo.

Cromatografia de fluido supercrítico

Cromatografia de fluido supercrítico é uma técnica de separação em que a fase móvel é um fluido de cima e relativamente próximo da sua temperatura e pressão críticas.

Técnicas de separação por mecanismo

Cromatografia de troca iônica

Cromatografia de troca iônica (normalmente referido como cromatografia de íons) utiliza um mecanismo de troca iónica para separar analitos com base em seus respectivos encargos. É geralmente realizada em colunas, mas também pode ser útil no modo de planar. Cromatografia de permuta iónica utiliza uma fase estacionária carregada para separar compostos carregados incluindo aniões , catiões , aminoácidos , péptidos e proteínas . Em métodos convencionais, a fase estacionária é um resina de troca iônica que transporta cobrado grupos funcionais que interagem com os grupos com carga oposta do composto a reter. Cromatografia de permuta iónica é utilizada para purificar proteínas usando FPLC.

A cromatografia de exclusão de tamanho

A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é também conhecido como a cromatografia de permeação em gel (GPC) ou cromatografia de filtração em gel e separa as moléculas de acordo com o seu tamanho (ou mais precisamente de acordo com o seu diâmetro hidrodinâmico ou volume hidrodinâmico). Moléculas mais pequenas são capazes de entrar nos poros dos meios de comunicação e, portanto, as moléculas são retidas e removidas do fluxo da fase móvel. O tempo médio de residência nos poros depende do tamanho efectivo das moléculas de analito. No entanto, as moléculas que são maiores do que o tamanho médio de poro da embalagem e, portanto, são excluídos sofrem essencialmente sem retenção; tais espécies são o primeiro a ser eluído. Geralmente, é uma técnica de cromatografia de baixa resolução e, portanto, muitas vezes é reservado para o final, "polir" passo de uma purificação. Também é útil para a determinação do estrutura terciária e estrutura quaternária de proteínas purificadas, especialmente uma vez que pode ser levada a cabo sob nativas solução condições.

Expandido Adsorção Bed (EBA) Separação cromatográfica

Leito de adsorção (EBA) Separação cromatográfica expandido capta uma proteína alvo a partir de uma corrente de alimentação em bruto, quando ele passa através de um sistema de coluna de cromatografia contendo esferas de adsorvente. Com esta técnica, a matéria-prima em bruto pode ser tratado directamente na coluna cromatograf ica, evitando a clarificação e pré-tratamento de etapas tradicionais. EBA separação cromatográfica é altamente escalável, a partir de 1 centímetro de diâmetro colunas em laboratório para grandes colunas de produção de até 2 metros de diâmetro. Estas colunas pode tipicamente lidar com estoque de alimentação de transferência de mais de 1000 mil litros por dia, com uma capacidade de produção de 1.000 proteína MT por ano.

Técnicas especiais

Cromatografia em fase reversa

Cromatografia de fase reversa é um procedimento de eluição usado na cromatografia líquida em que a fase móvel é significativamente mais polar do que a fase estacionária.

Cromatografia bidimensional

Em alguns casos, a química dentro de uma dada coluna pode ser insuficiente para separar alguns analitos. É possível dirigir uma série de picos não resolvidos para uma segunda coluna com diferentes propriedades físico-químicas ( Classificação química) propriedades. Uma vez que o mecanismo de retenção sobre este novo suporte sólido é diferente a partir da primeira separação dimensional, pode ser possível separar os compostos que se distinguem por cromatografia unidimensional. A amostra é visto de um canto de uma placa quadrada, desenvolvido, secou-se ao ar, em seguida, rodado em 90 ° e geralmente reconstruído em um segundo sistema solvente.

Cromatografia de leito móvel simulado

Cromatografia de gás de pirólise

A pirólise espectrometria de massa por cromatograf ia gasosa é um método de análise química, em que a amostra é aquecida a decomposição para produzir moléculas mais pequenas que são separadas por cromatografia em fase gasosa e detectados utilizando espectrometria de massa.

A pirólise é a decomposição térmica de materiais em uma atmosfera inerte ou um vácuo. A amostra é colocada em contacto directo com um fio de platina, ou colocada num tubo de amostra de quartzo, e rapidamente aquecida a 600-1000 ° C. Dependendo da aplicação, as temperaturas ainda mais elevadas são usadas. Três técnicas diferentes de aquecimento são usados em pyrolyzers reais: forno isotérmico, aquecimento indutivo (Curie Ponto de filamentos), e de aquecimento resistivos usando filamentos de platina. Clivar moléculas grandes em seus pontos mais fracos e produzir fragmentos menores, mais voláteis. Estes fragmentos podem ser separados por cromatografia em fase gasosa. A pirólise cromatogramas GC são tipicamente complexa porque uma grande variedade de diferentes produtos de decomposição é formado. Os dados podem ser utilizados como impressões digitais para provar a identidade ou o material de dados de GC / MS é usado para identificar os fragmentos individuais para se obter informação estrutural. Para aumentar a volatilidade dos fragmentos polares, vários reagentes de metilação pode ser adicionado a uma amostra antes de pirólise.

Além do uso de pyrolyzers dedicados, pirólise GC de amostras sólidas e líquidas podem ser realizadas directamente no interior de temperatura programável vaporizador (VPT) injectores que fornecem aquecimento rápido (até 30 ° C / s) e altas temperaturas máximas de 600-650 ° C. Isto é suficiente para algumas aplicações de pirólise. A principal vantagem é que nenhum instrumento específico tem que ser adquirido e a pirólise pode ser realizada como parte da rotina de análise por CG. Neste caso quartzo GC forros de entrada de ar tem que ser utilizado. Os dados quantitativos podem ser adquiridos, e bons resultados de derivatização no interior do injector de PTV são publicados bem.

Cromatografia líquida de proteínas rápida

Proteína rápido cromatografia líquida (FPLC) é um termo aplicado a várias técnicas de cromatografia que são utilizados para purificar proteínas. Muitas dessas técnicas são idênticas às efectuadas sob cromatografia líquida de alto desempenho, no entanto o uso de técnicas de FPLC são tipicamente para a preparação de lotes em grande escala de um produto purificado.

Cromatografia contracorrente

Um exemplo de um sistema de HPCCC

Cromatografia em contracorrente (CCC) é um tipo de cromatografia líquido-líquido, em que ambas as fases estacionárias e móveis são líquidos. O princípio de funcionamento do equipamento CCC requer uma coluna que consiste num tubo aberto enrolada em torno de uma bobina. A bobina é girada num eixo giratório-duplo movimento (um cardióide), o que faz com que um campo de gravidade variável (G) para actuar sobre a coluna durante cada rotação. Este movimento faz com que a coluna para ver um passo de particionamento por rotação e os componentes da amostra em separado na coluna devido ao seu coeficiente de partição entre as duas fases líquidas imiscíveis utilizados. Existem muitos tipos de CCC disponível hoje. Estes incluem HSCCC (CCC de alta velocidade) e HPCCC (High CCC Performance). HPCCC é a versão mais recente e melhor desempenho da instrumentação disponível atualmente.

Cromatografia quiral

Cromatografia quiral envolve a separação de estereoisómeros. No caso de enantiómeros, estes não têm diferenças químicas ou físicas para além de serem imagens de espelho tridimensional. Cromatografia convencional ou outros processos de separação são incapazes de separá-los. Para permitir separações quirais ter lugar, quer na fase móvel quer na fase estacionária si deve ser feita quiral, dando diferentes afinidades entre os analitos. As colunas de HPLC (cromatografia quiral com uma fase estacionária quiral) em fase normal e invertida estão disponíveis comercialmente.

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